Úvahy o různých typech vzorků#
Existuje mnoho různých možností pro typy vzorků k zobrazení a pokroky v technikách přípravy vzorků a zobrazovacích modalitách neustále posouvají možnosti zobrazování rozmanitějších a složitějších biologických vzorků. Stejně jako u mnoha jiných aspektů experimentálního designu přichází výběr typu vzorku s kompromisy. Vzorky, které lze snadno připravit a zobrazit, bývají malé, tenké a relativně čiré (např. jako monovrstva kultivovaných buněk). Takové vzorky mají zjevné výhody a mohou být zobrazeny vysoce výkonným způsobem, ale nejsou vhodné pro každou biologickou otázku. Někdy je potřeba snímat i silnější vzorek, jako je organoid, nebo celá tkáň nebo tkáň nakrájená na řezy, zvláště když biologická otázka zahrnuje interakce mezi různými typy buněk. Pečlivě zvažte, jaký biologický kontext je pro vaši otázku vhodný a jaká měření byste nakonec chtěli provést. Níže shrnujeme některé běžné typy vzorků
🤔 Jaké mám možnosti?
Zde uvádíme některé hlavní kategorie pro typy vzorků. Všimněte si, že mezi těmito různými kategoriemi neexistují pevné hranice (např. buňky i organoidy lze kultivovat ve 3D, mnoho z těchto vzorků lze zobrazit živě nebo po fixaci), ale některé obecné výhody a nevýhody jsou shrnuty níže.
Kultivované buňky
Mnoho různých typů buněk může být kultivováno nebo pěstováno v misce. Buňky mohou být pěstovány v monokultuře, pouze s jedním buněčným typem, nebo ve společné kultuře s více buněčnými typy.
Výhody
Kultivované buňky mají tendenci být relativně jednoduché na zobrazení a pro mnoho otázek mohou být zobrazeny širokoúhlou mikroskopií (viz [Akvizice] (obsah/výběr mikroskopu)), která je rychlejší a dostupnější než metody konfokální nebo superrozlišovací. Kromě toho mohou vysoce výkonné mikroskopy integrované s robotikou umožnit automatizaci experimentů a zobrazování s kultivovanými buňkami.
Buňky lze zmrazit, rozmrazit a vypěstovat mnohem rychleji než při práci se složitějšími vzorky, jako jsou organoidy nebo celé organismy, což zkracuje dobu potřebnou k provedení experimentu.
Nevýhody
Většina aplikací v mikroskopii vyžaduje zobrazení přes krycí sklíčko specifické tloušťky a tolerance. Mnoho typů buněk však nepřežije nebo nemůže růst na skle a vyžaduje další potažení a manipulaci s krycím sklíčkem, aby se zajistilo zdraví vzorku. Jako alternativu některé společnosti vyrábějí zobrazovací komory (vícejamkové destičky, 35mm misky…) s patentovanými polymery, které mají podobné vlastnosti jako sklo (optické polymery), a umožňují tak zobrazování s vysokým rozlišením. Je nezbytné pochopit, zda imerzní olej použitý během zobrazování ovlivňuje integritu těchto polymerů, protože rozpouštědla v některých imerzních médiích mohou popraskat nebo rozpustit polymerní vrstvu.
Organoidy
Organoidy jsou kultivované buňky, které se pěstují ve 3D, aby napodobily strukturu a někdy i funkce orgánů. Organoidy se typicky pěstují z kmenových buněk, které se samy organizují do složitější struktury, včetně diferenciace na různé typy buněk. Organoidy jsou vhodné pro otázky vývoje, modelování onemocnění a pro pochopení regenerace tkání a orgánů.
Výhody
Protože organoidy obsahují více typů buněk a odrážejí určitou strukturu a buněčné vztahy pozorované v orgánech in vivo, jsou vhodné pro složitější otázky týkající se onemocnění a interakcí buňka-buňka. Mohou být také použity k modelování procesů a struktur, které jsou nutně 3D a nejsou dobře rekapitulovány v ploché vrstvě buněk, jako mnoho vývojových procesů.
Organoidy mohou být vyrobeny z indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) z lidských nebo zvířecích vzorků, a tak mohou modelovat chorobné procesy specifické pro daného lidského dárce.
Nevýhody
Organoidy mohou k růstu vyžadovat složitější zdroje a protokoly a může zabrat více času než pouhé pěstování kultivovaných buněk na skle nebo plastu.
Protože organoidy jsou 3D struktury, často nejsou přístupné širokoúhlému zobrazování a mohou vyžadovat zobrazení spinning diskem nebo bodovou konfokální mikroskopii.
Tkáň
Tkáně vznikají, když buňky společně plní určitou funkci. Tkáně lze kultivovat tak, že se odebere kus živočicha nebo rostliny a nechá se dále přežívat a růst v misce. Tkáně lze také odebrat z rostlin nebo zvířat a obarvit je na přítomnost různých molekul. Tkáně se obvykle rozřežou na kousky (tzv. {term}“rozřezání tkáně“) a mohou být fixované, čerstvé nebo zmrazené, nebo dokonce živé při {term}“zobrazování ex-vivo“.
Výhody
Tkáně mají více neporušených interakcí buňka-buňka, které jsou obecně více reprezentativní pro to, co se děje in vivo než v buněčné kultuře.
Úložiště darovaných lidských tkání umožňuje biomedicínskému výzkumu studovat různorodý vzorek pacientů s konkrétním onemocněním.
Nevýhody
Primární buňky a tkáně mají tendenci být citlivé na prostředí než imortalizované buněčné linie a jejich růst může být obtížnější a mohou vyžadovat specializované protokoly v závislosti na typu buňky.
Tkáně odebrané z celého zvířete nebo rostliny vyžadují před sklizní čas na vývoj a růst daného vzorku.
Celý organismus / embryo
Některé celé organismy jsou tenké a dostatečně průhledné pro zobrazení. Některá zvířata mají také téměř průhledná embryonální stádia, jako je zebrafish. Kromě toho {term} ‚intravitální zobrazování‘ je zobrazování buněčných struktur nebo biologických procesů uvnitř živého zvířete v reálném čase, bez extrahování orgánů nebo fixace vzorku. Obecně to vyžaduje specifické vybavení nebo modality se zlepšenou penetrací světla, jako je multifotonová mikroskopie, a je omezena na možnost přístupu ke konkrétnímu orgánu, často přes optická okna.
Výhody
Zobrazování celých organismů nebo embryí poskytuje při studiu určitého procesu nebo struktury co nejvíce neporušeného biologického kontextu.
Nevýhody
Zobrazování silnějších vzorků může vyžadovat zpracování (čištění tkáně) vzorku, aby jeho index lomu odpovídal indexu lomu zobrazovacího média a omezilo absorpci a rozptyl světla.
Intravitální zobrazování často vyžaduje specifické chirurgické techniky a je kontrolováno bioetickými komisemi a musí být schváleno IACUC a/nebo jinými institucionálními komisemi.
⚠️ Kde se může něco pokazit?
Fotobleaching a fototoxicita - Fotobleaching lze definovat jako nevratnou destrukci fluoroforu v jeho excitovaném stavu, což znamená, že fluorofor není schopen emitovat další světlo, a fluorescenční signál se proto časem zhoršuje, což ovlivňuje poměr signálu k šumu a měření intenzity. Aby se minimalizovalo fotobleaching během akvizice, existuje řada fotobleachingových činidel, která lze přidat do média. Tato činidla minimalizují fotobleaching fluoroforů v různé míře, a proto je důležité kontaktovat výrobce, aby se ujistil, že jsou optimální pro konkrétní fluorofor. Například přidání zachycovačů kyslíku do zobrazovacího média, jako je glukóza oxidáza nebo pyranóza 2-oxidáza, může výrazně snížit fotobleaching. Je důležité si uvědomit, že použití {term}“zachycovačů kyslíku“ může ovlivnit zobrazování živých buněk, protože tyto zachycovače mohou ovlivnit hladinu ATP a kyslíku ve vzorku, a tím ohrozit jeho zdraví, a tedy biologickou funkci.
Buňky umírají - Fluorescenční světlo vyvolává poškození DNA a oxidaci buněčných složek (fototoxicita). Kromě toho může fluoroforový fotobleaching dále indukovat fototoxicitu vytvářením reaktivních forem kyslíku (ROS). Přidání antioxidantů a odstranění určitých molekul (např. riboflavinu) ze zobrazovacího média může snížit ROS produkované během zobrazování a zlepšit zdraví vzorku.6
Moje fixované buňky nevypadají podle očekávání - Fixace může změnit lokalizaci a fluorescenci různých proteinů. Kde je to možné, vždy porovnejte distribuci sledovaného proteinu nebo molekuly s fixací a bez fixace. Zvažte také, zda není pro váš vzorek vhodnější jiná metoda fixace.
Můj vzorek je příliš neprůhledný - Tlustší vzorky, jako jsou tlusté tkáňové řezy, pigmentované buňky nebo celé organismy, mohou být náročné na zobrazení v důsledku absorpce a rozptylu světla vyvolaného nehomogenitami indexu lomu uvnitř tkáně samotné, což má za následek špatné pronikání světla. Aby se usnadnilo zobrazování tkání, výzkumníci často řežou tlusté tkáně na plátky různé tloušťky. Tento proces se nazývá řezání tkání. Ve většině případů se vzorky fixují a zalijí do parafínu nebo zmrazí v médiu pro zmrazení tkání a později se nařežou na tenké plátky pomocí stroje, jako je kryostat, mikrotom nebo vibratom, a řezy se odeberou do zkumavky nebo na sklíčko. Alternativně většina složek v jakémkoli komplexním biologickém systému, jako je orgán, není obsažena v tomto dvourozměrném objemu, a proto tento přístup ohrožuje pochopení prostorových vztahů mezi buněčnými složkami. Čištění tkáně se zaměřilo na snížení nehomogenit ve tkáni vyrovnáním indexu lomu v celém vzorku. To umožňuje světlu procházet tkání, a proto umožňuje objemové zobrazení celých orgánů a tkání s vysokým rozlišením pomocí konvenčních mikroskopických technik, jako je konfokální mikroskopie, bez nutnosti fyzického řezání vzorku.