Praktické úvahy#
Objektivní výběr#
Mikroskopické objektivy mají řadu vlastností, které je třeba vzít v úvahu při rozhodování, který objektiv je vhodný pro váš experiment.
Zvětšení a rozlišení: čím vyšší je numerická apertura (NA) objektivu, tím jemnější rozlišení lze získat ve vzorku. NA se vypočítá jako \(NA=RI * sin(θ)\), vztahující se jak k indexu lomu vzorku, skla a ponornému médiu, tak k rozsahu úhlů vyzařované světlo, které lze sbírat do čočky. Pokud nejsou použity speciální techniky, typická mez výsledku se vypočítá jako \(d = λ / 2NA\), což znamená, že rozlišení je nastaveno jak NA objektivu, tak i vlnovou délkou světla použitého pro zobrazování.
Obr. 5 Snížené rozlišení při delších vlnových délkách světla. Mikrotubuly zobrazené při kratší vlnové délce světla vykazují vyšší rozlišení než mikrotubuly zobrazené při delších vlnových délkách. Adaptováno podle Jonkmana J., Browna C.M., Wrighta G.D et al. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Prot 15, (2020) 5#
Korekce barev: Při provádění vícebarevné mikroskopie je důležité vybrat čočku objektivu, která je označena jako „Apo“ nebo „Super Apo“, protože tyto čočky jsou korigovány tak, aby zaostřily 3 až 6 barev ve stejné rovině současně. „Fluor“ čočky obvykle zaostří dvě barvy najednou.
Pracovní vzdálenost: Pracovní vzdálenost (WD) udává vzdálenost v milimetrech, kterou může čočka zaostřit na vzorek. Tato vzdálenost zahrnuje také krycí sklíčko a montážní médium. Při zobrazování tlustého vzorku a/nebo pokud je potřeba zobrazovat mimo povrch vzorku, je důležité zajistit, aby čočka měla dostatečnou pracovní vzdálenost.
Sady filtrů#
Je důležité se ujistit, že mikroskop, na kterém chcete zobrazovat, má správné sady filtrů pro fluorfory, které chcete použít. Další informace naleznete v části o bleedthrough.
Z-vzorkování#
Chcete-li zachytit více řezů z, je vzdálenost mezi těmito řezy důležitá, chcete-li být schopni provést přesnou 3D rekonstrukci. SVI má plné matematické vysvětlení a také snadno použitelnou online kalkulačku, kterou můžete použít abyste vypočítali optimální rozteč řezů z pro vaše zobrazovací podmínky.
Akviziční výkon/rychlost#
Množství signálu zachyceného z jakéhokoli fluoroforu bude souviset nejen s vnitřním jasem fluoroforu, ale také s množstvím excitačního světla, kterému je vystaven (kvůli trvání, výkonu nebo obojímu), stejně jako množství času a signálu. násobení, ke kterému dochází na detektoru (typicky kamera nebo fotonásobič (PMT)). Optimální experiment je typicky takový, který minimalizuje množství světla dopadajícího na vzorek (pro snížení fotobleachingu a/nebo fototoxicity) při dosažení adekvátního fluorescenčního signálu a v minimálním čase na zařízení. Jak přesně vyvážit tyto konkurenční faktory bude záviset na přesné biologii, která je studována, a na omezeních výzkumníka.