Praktické úvahy#
Doporučujeme se podívat na Microtutor a MyScope, kde najdete interaktivní vysvětlení mnoha z těchto konceptů!
Objektivní výběr#
Mikroskopické objektivy mají řadu vlastností, které je třeba vzít v úvahu při rozhodování, který objektiv je vhodný pro váš experiment.
Magnification and resolution: the higher the numerical aperture (NA) of the lens, the finer the resolution one can obtain in one’s sample. The NA is calculated as \(NA=RI * sin(θ)\), relating both to the refractive index of the sample, glass, and immersion media as well as the range of angles of emitted light that can be collected into the lens. Unless special techniques are used, the typical limit of resolution is calculated as \(d = λ / 2NA\), meaning the resolution is set both by the NA of the lens but also by the wavelength of light used for imaging.
Obr. 5 Snížené rozlišení při delších vlnových délkách světla. Mikrotubuly zobrazené při kratší vlnové délce světla vykazují vyšší rozlišení než mikrotubuly zobrazené při delších vlnových délkách. Adaptováno podle Jonkmana J., Browna C.M., Wrighta G.D et al. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Prot 15, (2020) 5#
Korekce barev: Při provádění vícebarevné mikroskopie je důležité vybrat čočku objektivu, která je označena jako „Apo“ nebo „Super Apo“, protože tyto čočky jsou korigovány tak, aby zaostřily 3 až 6 barev ve stejné rovině současně. „Fluor“ čočky obvykle zaostří dvě barvy najednou.
Pracovní vzdálenost: Pracovní vzdálenost (WD) udává vzdálenost v milimetrech, kterou může čočka zaostřit na vzorek. Tato vzdálenost zahrnuje také krycí sklíčko a montážní médium. Při zobrazování tlustého vzorku a/nebo pokud je potřeba zobrazovat mimo povrch vzorku, je důležité zajistit, aby čočka měla dostatečnou pracovní vzdálenost.
Sady filtrů#
It is important to make sure that the microscope that you want to image on has the correct filter sets for the fluorophores you wish to use. See the section on bleedthrough for more information.
Z-vzorkování#
If you wish to capture multiple z sections, the spacing of these sections is important if you wish to be able to perform an accurate 3D reconstruction. SVI has a fuller mathematical explanation of this,as well as an easy-to-use online calculator that you can use to calculate the optimal z section spacing for your imaging conditions.
Akviziční výkon/rychlost#
The amount of signal captured from any fluorophore will be related not just to the intrinsic brightness of the fluorophore, but also the amount of excitation light it is exposed to (due to duration, power, or both) as well as amount of time and signal multiplication that happens at the detector (typically a camera or a photomultiplier tube (PMT)). An optimal experiment is typically one that minimizes the amount of light hitting the sample (to reduce photobleaching and/or phototoxicity) while achieving adequate fluorescent signal and in minimal time on the equipment. How exactly to balance these competing factors will depend on the exact biology being studied and the researcher’s constraints.