Experimentální rozhodnutí o designu#

Při navrhování experimentu s kvantitativním biozobrazováním je třeba učinit řadu zásadních rozhodnutí. Mnoho z těchto rozhodnutí bude hluboce záviset na tom, co je možné vzhledem k biologii, kterou chcete studovat. Například:

  • Vždy budete preferovat živé zobrazování před fixním, pokud je důležité posoudit dynamiku daného procesu

  • Možná budete muset provést speciální procesy, jako je čištění tkáně, pokud je důležité zobrazit hluboko do relativně neprůhledného vzorku

  • Nemůžete se spoléhat na genetické značení fluorescenčními proteiny, pokud váš modelový systém není geneticky poddajný takovým manipulacím

  • Chcete-li s jistotou posoudit interakce mezi dvěma molekulami zobrazenými ve stejném systému, musíte zobrazovat ve zvláště vysokém rozlišení

Je proto mimořádně důležité promyslet si všechny aspekty své biologické otázky, než vůbec vezmete do ruky pipetu nebo sklíčko. Mnoho rozhodnutí o přípravě vzorků je hluboce spjato s dostupností a vhodností konkrétních mikroskopů; další informace naleznete v tato sekci.

Montáž#

Skleněná krycí sklíčka#

Mnoho zobrazovacích aplikací zahrnuje montáž na krycí sklíčka, a to buď přímo, nebo pomocí krycího sklíčka upevněného do misky. Přestože existuje široká škála velikostí a tvarů krycích sklíček, nejdůležitějším atributem je tloušťka krycího sklíčka. Třída krycího sklíčka určuje očekávanou tloušťku a toleranci. Tyto faktory jsou důležité, protože většina výrobců mikroskopů předpokládá při konstrukci čoček objektivu specifickou tloušťku krycího sklíčka (0,17 mm), aby se minimalizovaly aberace. Tyto aberace mají tendenci ovlivňovat jas a axiální rozlišení, čímž snižují poměr signálu k šumu, ostrost a rozlišení. Tolerance krycího sklíčka (pro minimalizaci proměnlivosti tloušťky) je nezbytná pro techniky s vysokým rozlišením nebo měření intenzity na snímcích shromážděných objektivy s vysokou numerickou aperturou. Jiné aplikace nevyžadují montáž vzorků na sklo nebo plast, ale místo toho mají vzorek a čočku objektivu ponořeny do stejného média.

Tabulka 1 Porovnání tříd krycích sklíček#

Třída

Jmenovitá tloušťka [mm]

Rozsah tloušťky [mm]

#1.5

0,17

0,16 - 0,19

#1,5H

0,17

0,165 - 0,175

Montážní média#

index lomu, do kterého je vzorek umístěn, stejně jako index lomu skla a prostředí mezi objektivem a vzorkem jsou rozhodující pro určení dosažitelného rozlišení. {term}‘Montážní médium‘ může mít další důležité optické a/nebo experimentální vlastnosti; pro plánovaný experiment je důležité použít správné montážní médium.

účinky montážního média

Obr. 3 Vliv montážního média na barvení různými fluorofory. Adaptováno podle Jonkmana J., Browna C.M., Wrighta G.D et al. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Prot 15, (2020) 5#

Výběr fluoroforů#

Fluorofory jsou molekuly, které jsou schopny emitovat světlo po absorpci fotonu, typicky kratší vlnové délky. Fluorofory relevantní pro biomedicínský výzkum mohou být malá molekulová organická barviva (FITC, Alexa Fluor 488), která vážou specifickou buněčnou strukturu (např. DAPI, MitoTracker), fluorescenční analogy malých molekul (např. faloidin, fluorescenční aminokyseliny) nebo fluorescenční proteiny. Některé z důležitých vlastností, které je třeba vzít v úvahu při výběru fluoroforů, jsou uvedeny níže:

  • Excitační/emisní spektra každého fluoroforu

  • Jas (barviva mají tendenci být jasnější než proteiny)

  • Fotostabilita

  • Sklon k oligomerizaci (v případě fluorescenčních proteinů)

  • Fototoxicita (při zobrazování v živých vzorcích)

Porozumění fluoroforům, specifikacím mikroskopu (světelný zdroj, filtry, detektor) a cílům analýzy jsou klíčem k výběru vhodných fluoroforů pro řešení vědecké otázky. Další informace naleznete v části [reprodukovatelnost] (obsah/reprodukovatelnost).