Glosář

Blokování

Během postupu imunobarvení je důležité minimalizovat nespecifickou vazbu primárních nebo sekundárních protilátek. Ve většině případů je toho dosaženo blokováním, které typicky zahrnuje přidání látek, jako je normální sérum, želatina nebo albumin, před imunobarvením, aby se „obsadila“ všechna nespecifická vazebná místa ve vzorku.

Dekonvoluce

Proces výpočetního odstraňování neostrosti z mikroskopických snímků pomocí známých optických vlastností světelné dráhy k „přeřazení“ intenzity pixelů pryč od místa dopadu na kameru a zpět na strukturu, která vyzařovala světlo.

Ex-vivo zobrazování

Odkazuje na zobrazování prováděné na živé zvířecí tkáni ve vnějším kontrolovatelném prostředí (např. tkáňový explantát na Petriho misce). Umožňuje zobrazení živé tkáně s vysokým rozlišením, která může být jinak u zvířete nedostupná. Tkáň je na zobrazovacím systému udržována naživu perfuzí okysličeného (95 % kyslíku a 5 % CO2) média s řízenou teplotou pomocí peristaltických čerpadel a mikrofluidiky.

Fiji

Fiji Is Just ImageJ. ImageJ2 plus spousta běžných pluginů.

Fixace

Fixace vzorku znamená stabilizaci buněčných/molekulárních složek ve vzorku při současném zastavení jakékoli biologické funkce v tomto vzorku. Použité fixační činidlo (např. paraformaldehyd, glutaraldehyd, methanol), koncentrace a podmínky (např. pufr, teplota) určují rozsah zachování buněčných a/nebo molekulárních struktur ve vzorku a je třeba je optimalizovat v závislosti na vzorku resp. struktura, která se zobrazuje.

Zpracování obrazu

Je operace, kterou lze provést s obrázkem a výsledkem je další obrázek. Operace zpracování obrazu mohou být jednoduché (např. změna velikosti nebo otočení) nebo pokročilejší (např. vylepšení určitých vlastností obrazu, jako jsou kruhy nebo čáry).

Imerzní média

Imerzní médium je médium, které vyplňuje mezeru mezi čočkou objektivu a krycím sklem nebo vzorkem. Ovlivňuje numerickou aperturu čočky objektivu \(NA=RI * sin(θ)\), čímž ovlivňuje laterální a axiální rozlišení. Je důležité sladit RI imerzního média s RI montážního média, aby se minimalizovaly aberace a zlepšila se kvalita obrazu. Imerzní médium může být vzduch, voda, silikonový olej, glycerol nebo olej.

Imunolabeling

Imunooznačení je jednou z nejběžnějších technik značení fixovaných vzorků. K detekci sledovaného proteinu můžete použít fluorescenčně konjugované primární protilátky nebo dvoukrokové značení primární protilátkou a fluorescenčně konjugovanou sekundární protilátkou. Primárně-sekundární značení má tendenci vést k zesílení signálu. Hlavním problémem imunoznačení je velikost protilátek, které vyžadují rozsáhlou permeabilizaci. Další dobrou možností je použít nano-tělesa, která mají pouze těžký řetězec a jsou výrazně menší než běžné protilátky.

Intravitální zobrazování

Vztahuje se k zobrazení buněčných struktur nebo biologických procesů uvnitř živého zvířete v reálném čase, bez extrahování orgánů nebo fixace vzorku. Obecně to vyžaduje specifické vybavení nebo modality se zlepšenou penetrací světla, jako je multifotonová mikroskopie, a je omezena na možnost přístupu ke konkrétnímu orgánu, často přes optická okna. Na intravitální zobrazování dohlížejí bioetické komise a musí být schváleny IACUC a/nebo jinými institucionálními komisemi.

Montážní média

Je řešení, ve kterém je váš vzorek umístěn (namontován). Jeho účelem je uchovat vzorek, včetně fluoroforů v něm, a zlepšit kvalitu zobrazení během akvizice pufrováním pH, přizpůsobením indexu lomu v celém vzorku (ideálně tak, aby odpovídal indexu lomu skla) a minimalizací fotobělení (v závislosti na střední). Upevňovací médium zabraňuje vysychání vzorku a umožňuje dlouhodobé skladování.

Detekce objektů

Je technika zpracování obrazu pro detekci objektů v obraze. Neposkytuje masky objektů, ale ohraničující rámeček objektu nebo polohu x, y.

Lapače kyslíku

Kyslík má tendenci vyvolat fotobleaching organických barviv a jiných fluoroforů. Přidání lapačů kyslíku do zobrazovacího média, jako je glukóza oxidáza nebo pyranóza 2-oxidáza, může významně snížit fotobleaching fluoroforů přítomných ve vzorku. Je důležité pochopit, že použití pohlcovačů kyslíku může ovlivnit zobrazování živých buněk, protože tyto pohlcovače mohou ovlivnit hladinu ATP a kyslíku ve vzorku, čímž ohrozí jeho zdraví a tím i biologickou funkci.

Permeabilizace

Aby protilátky používané během imunobarvení nebo jiné fluorofory pronikly a navázaly se na svůj antigen v buňce nebo tkáni, je třeba integritu membrány (otvory) napadnout slabým detergentem. Krok permeabilizace musí být pečlivě optimalizován v závislosti na požadovaném antigenu, protože může vést ke ztrátě cytoplazmy nebo degradaci signálu.

Index lomu

Je to měřítko toho, jak světlo prochází konkrétním médiem. Je to důležitá hodnota při výpočtu numerické apertury objektivu. V ideálním případě by měl být nesoulad indexu lomu mezi vzorkem (montážním médiem), krycím sklíčkem a imerzním médiem minimalizován, aby se zlepšila kvalita obrazu. Podívejte se na interaktivní ukázku indexu lomu na MicroscopyU

ROI

Oblasti zájmu. Pixely na obrázku, které vás zajímají (např. oblast tkáně, buňka, nádor atd.)

Segmentace

Metoda rozdělení obrazu na více částí nebo oblastí. Existují tři různé typy segmentace.

• Sémantická segmentace, kde jsou všechny části obrázku součástí třídy, běžná v buněčné biologii bude detekce buněk a pozadí na obrázku.

• Instance segmentace, segmentace je založena na objektu, nejen zjišťuje, kde buňky jsou, ale ponořuje každou buňku jako samostatný objekt.

• Panoptickou segmentaci lze definovat jako kombinaci předchozích dvou, protože objekt identifikuje, ale také klasifikuje. Příkladem v biologii může být detekce všech buněk na obrázku a jejich klasifikace jako dělící vs.

Prahování

Nejjednodušší forma segmentace obrazu, která rozděluje obraz na dvě části - pozadí a popředí (nebo signál). Vytvoří binární obraz, kde se obvykle pixely pozadí změní na hodnotu 0 a pixely objektu na hodnotu 1.

Čištění tkání

Fluorescenční zobrazování celé tloušťky kousku tkáně je velmi náročné kvůli absorpci a rozptylu světla indukovanému nehomogenitami v indexech lomu uvnitř tkáně samotné, což má za následek špatnou penetraci světla. Světlo přicházející z různých částí vzorku navíc přispívá k fluorescenčnímu rozostření, což drasticky snižuje kontrast a rozlišení v jakékoli dané rovině. Výsledkem je, že výzkumníci mají tendenci používat techniky řezání tkání k extrakci informací o buněčných složkách a jejich prostorové distribuci nebo vztazích z tenkého dvourozměrného objemu. Většina složek v jakémkoli složitém biologickém systému, jako je orgán, však není obsažena v tomto dvourozměrném objemu, a proto tento přístup ohrožuje pochopení prostorových vztahů mezi buněčnými složkami. Čištění tkáně se zaměřilo na snížení nehomogenit ve tkáni vyrovnáním indexu lomu v celém vzorku. To umožňuje světlu procházet tkání, a proto umožňuje objemové zobrazení celých orgánů a tkání s vysokým rozlišením pomocí konvenčních mikroskopických technik, jako je konfokální mikroskopie, bez nutnosti fyzického řezání vzorku.

Dělení tkání

Průnik světla a fluorescenční zobrazování je negativně ovlivněno rozptylem světla v tlustém vzorku. Tento rozptyl je způsoben různými indexy lomu přítomnými v tkáni. Aby se usnadnilo zobrazování tkání, výzkumníci často řežou tlusté tkáně na plátky různé tloušťky. Tento proces se nazývá řezání tkání. Ve většině případů se vzorky fixují a zalijí do parafínu nebo zmrazí v médiu pro zmrazení tkání a později se nařežou na tenké plátky pomocí stroje, jako je kryostat, mikrotom nebo vibratom, a řezy se odeberou do zkumavky nebo na sklíčko.