Kolokalizace#

Co je kolokalizace?#

Kolokalizace je situace, kdy se dvě nebo více různých značek (např. eGFP a mCherry) na snímku prostorově překrývají (nazývá se také kookurence). Další složkou kolokace je, že fluorescenční značky často korelují v intenzitě (tj. pixely se světlejším eGFP mají také světlejší mCherry). Je velmi důležité měřit kolokalizaci kvantitativně - nedůvěřujte jen svým očím!.

Je také důležité si uvědomit, že společný výskyt nutně neznamená interakci.

stupně kolokalizace

Obr. 6 Kolokalizace je o intenzitě a prostorovém překrytí oblastí#


📏 Jak měřit?

Existují dvě hlavní větve, jak se dívat na kolokalizaci: objektově založená a korelačně založená.

  • Kolokalizace založená na objektech je vhodná, když chcete být schopni říci něco o tom, že zlomek objektů je pozitivní pro více štítků (např. 99 % buněk eGFP+ bylo také mCherry+). Zde je ukázkový pracovní postup:

flowchart LR A[Raw image Label #1] -->|Segmentation| B((Identified objects \n eGFP+ cells)) C[Raw image Label #2] --> |Segmentation| D((Identified objects \n mCherry+ cells)) B & D -->E(Measure overlap per cell \n if overlap > threshold %, say colocalized )--> G(Fraction of eGFP+ cells also mCherry+) E --> H(Fraction of mCherry+ cells also eGFP+) classDef empty width:0px,height:0px; style A fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style B fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style C fill:#FFF4d6,stroke:#FFBE0B style C fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A style D fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A

  • Kolokace založená na korelaci je vhodnější, pokud se měřené značky nenacházejí v diskrétních objektech nebo pokud předpokládáte, že signál ve značkách by měl korelovat.Kolokace založená na korelaci je jednodušší na měření, protože nevyžaduje žádnou {termín}segmentaci objektů.Pearsonovy korelační koeficienty jsou snadno měřitelné ve většině softwarů pro analýzu obrazu (např. FIJI, CellProfiler atd.).

⚠️ Kde se může něco pokazit?

  • Nedostatečné kontroly (např. kontroly s jednou značkou, kde je přítomna pouze jedna fluorescenční značka). Šum, nerovnoměrné osvětlení a další technické artefakty mohou způsobit korelaci mezi dvěma kanály.

  • Neprovedení korekce posunu mezi kanály Je běžné, že mezi různými zobrazovacími kanály dochází k určitému posunu v důsledku rozdílů v optice (např. různé kostky filtrů). Pokud tento posun nekorigujete (např. měřením a použitím odpovídající korekce na kanály), může to omezit vaši schopnost detekovat kolokaci.

  • Bleedthrough Někdy signál z jednoho fluorescenčního kanálu proniká do jiného, což může falešně zvýšit vaši detekovanou kolokalizaci. K tomu dochází nejčastěji u fluoroforů, které jsou ve spektrech podobné (např. GFP a YFP). To je způsobeno tím, že fluorofor v jednom kanálu je slabě excitován světlem použitým k excitaci jiného fluoroforu a výsledná emitovaná fluorescence projde emisním filtrem (např. vaše zelené objekty se objeví také ve žlutém kanálu). Posuďte to pomocí ovládacích prvků s jedním štítkem.

  • Nesprávná interpretace vaší kolokalizační metriky Podrobnosti zde zvolené metriky jsou velmi důležité – značně se liší, pokud jde o zahrnutí pixelů na pozadí, jejich citlivost na signál/šum atd. Konzultace s odborníkem a zahrnutí správných kontrol vám může pomoci mít jistotu, že vaše měření je skutečně takové, jaké si myslíte.

📚🤷‍♀️ Kde se mohu dozvědět více?