Reprodukovatelnost

Při navrhování reprodukovatelného mikroskopického experimentu je rozhodující řada faktorů. Zde je uvedeno několik kritických faktorů; viz další díla, jako je ⁹

Validace protilátek

Zatímco v dokonalém světě by protilátky byly vždy specifické pro konkrétní cíl, bohužel se na to nelze vždy spolehnout při provádění imunologického značení. ¹⁰ Pokud je to možné, měli byste provést knockout a/nebo knockdown kontroly k potvrzení specifity protilátky; kde ne, vyhledejte dostupnost jiné protilátky k jiné části cílové molekuly (někdy nazývané epitop) a potvrďte, že máte konzistentní lokalizaci.

Optimalizace podmínek blokování a permeabilizace pro konkrétní protilátku a protokol může snížit nespecifické pozadí. Vždy by měly být také prováděny kontroly bez primární protilátky, protože jsou nezbytné pro ověření specifity signálu.

Ověření lokalizace fluorescenčního proteinu

Exprese fluorescenčně značených proteinů může umožnit lokalizaci molekuly nebo struktury, zvláště když neexistuje dobrá protilátka pro imunoznačení a/nebo bude užitečné pozorovat chování molekuly v živých buňkách. Zatímco studie porovnávající překrývání mezi stejnými molekulárními cíli s fluorescenčními proteiny vs. protilátkami zjistila 80% překrytí, zjistila také, že některé úvahy (například zda je C- nebo N-konec proteinu označen) mohou způsobit změny v lokalizaci. ¹¹. Nedávný dokument ¹² zkoumá úvahy o genetickém značení molekul pro živou mikroskopii.

Bleedthrough

Při provádění vícebarevné fluorescenční mikroskopie je důležité vybrat fluorofory s dostatečně odlišnými excitačními a emisními spektry; online nástroje, jako je FPbase ¹³, mohou pomoci s takovým výběrem, zvláště pokud znáte různé optické komponenty mikroskopu, na kterém budete své vzorky zobrazovat (tyto konfigurace lze uložit a sdílet na FPbase; zeptejte se správce mikroskopu, který plánujete použít, pokud je takový konfigurační soubor již online). I když se domníváte, že jsou vaše fluorofory dostatečně odděleny, je důležité zkontrolovat jednobarevné fluorescenční kontroly za stejných podmínek zobrazování (a nejlépe ve stejný den) jako u vícebarevných kontrol, abyste měli jistotu, že nedochází k prosakování; je to povinné udělat, pokud plánujete měřit [kolokalizace] (obsah/kolokalizace).