Měření intenzity#

Co to je měření intenzity?#

Intenzita se týká jasu signálu pro fluorescenční značení. Pomocí měření intenzity můžeme odvodit relativní množství fluoroforu nebo značení. Pokud tedy máte například protein označený fluoroforem, můžete změřit intenzitu tohoto fluoroforu, abyste získali relativní míru toho, kolik proteinu je přítomno ve vašem vzorku. Měření intenzity zahrnuje následující (neúplný) seznam, lze je měřit v rámci obrazu, v objektu, jako je buňka, v dílčích oblastech objektu:

  • Průměrná intenzita: průměrná intenzita napříč všemi pixely

  • Integrovaná intenzita: součet intenzit pixelů, zástupná hodnota pro celkové množství této značky v objektu

  • Měření textury: hladkost intenzit


📏 Jak měřit?

Intenzita se měří poměrně jednoduše, ale může být poměrně složité ji správně změřit (viz níže). Důrazně doporučujeme obrátit se na odborníka na analýzu obrazu, než se pustíte do tohoto typu analýzy, protože existuje mnoho míst, kde se může něco pokazit. Obecně platí, že chcete měřit buď na nezpracovaných snímcích, nebo na snímcích s korekcí osvětlení, ale obecně s minimálním {termín}zpracováním snímků. Korekce osvětlení je forma {termín}`zpracování obrazu``, která kompenzuje nerovnoměrný průběh osvětlení, který vzniká u většiny světelných zdrojů, kde je střed osvětleného pole jasnější než okraje. Měření intenzity pak lze provádět v jakémkoli standardním softwaru pro analýzu obrazu, a to buď v celém obraze, nebo v identifikovaných objektech. Příklad pracovního postupu viz níže:

flowchart LR A[Raw image] -->|"Correct uneven illumination\n (optional, but best practice)" | B[Corrected image]-->|Segmentation|C((Identified objects \n e.g., cells)) B -->|Measure intensity| E(Image-level intensity \nmeasurements) C -->|Measure intensity| F(Object-level intensity \nmeasurements) classDef empty width:0px,height:0px; style A fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style B fill:#D0F1E3,stroke:#57CC99 style C fill:#FFF4d6,stroke:#FFBE0B style C fill:#FFD6E8,stroke:#F5006A
⚠️ Kde se může něco pokazit?

  • Saturace Nasycené pixely jsou tak jasné, že jejich hodnoty intenzity maximálně převyšují náš detektor (kameru). Pokud máte v buňkách, které se pokoušíte měřit, nasycené pixely, většinu měření intenzity opravdu nemůžete provést. Je to proto, že u nasycených pixelů nevíte, jak jasné jsou ve skutečnosti, ale že jsou jasnější, než můžete detekovat. Existují některá měření intenzity, která jsou odolná vůči určitému nasycení. Například střední intenzita obrázku nebude saturací ovlivněna, pokud nemáte > ½ obrázku nasyceného. Ale měření jako střední intenzita budou ovlivněna saturací.

  • Neadekvátní kontroly Ve většině případů přesné míry intenzity, které získáte, neznamenají nic biologicky izolovaně. Pouze srovnáním podmínek můžeme získat nějaký biologický vhled. Kontrolní podmínka je proto velmi důležitá pro srovnání s vašimi experimentálními podmínkami.

  • Neodpovídající podmínky zobrazování napříč experimentálními podmínkami Vzhledem k tomu, že měření intenzity je ovlivněno dobou expozice, intenzitou světelného zdroje a dalšími faktory, je velmi důležité porovnat nastavení zobrazování napříč vzorky. V souvislosti s tím byste měli dbát na to, abyste neoddělovali zobrazování experimentálních a kontrolních podmínek do různých dnů, pokud se tomu lze nějakým způsobem vyhnout. Fluorofory mohou ve vzorcích v průběhu času slábnout, což komplikuje interpretaci, pokud byly různé typy vzorků zobrazovány v různých dnech.

📚🤷‍♀️ Kde se mohu dozvědět více?