Úvod

Mikroskopy jsou optické přístroje a jako takové se skládají z různých optických součástí a zařízení. Pro začátečníka je důležité rozpoznat experimentální parametry, které mohou ovlivnit kvalitu a přesnost zobrazovaných dat a potažmo i jejich interpretaci.

Základním konceptem je „světelná dráha“, kterou lze použít ke sledování trajektorie světla od zdroje světla k detektoru. Při práci s mikroskopy, ať už se jedná o mikroskop s buněčnou kulturou nebo špičkový systém s vysokým rozlišením, je důležité věnovat čas sledování různých světelných drah v systému. Přístup k systému jako k součtu jeho částí znamená, že optimalizace a odstraňování problémů se stávají systematickými procesy ve srovnání s tím, kdy je systém považován za černou skříňku. Tento interaktivní výukový program na MicroscopyU ukazuje světelné dráhy ve standardním inverzním mikroskopu; toto zobrazení poskytuje další podrobnosti o různých částech.

Typy mikroskopů

I když to zdaleka není úplný seznam toho, co je k dispozici, níže je uvedeno několik nejběžnějších typů mikroskopů.

• Widefield, někdy nazývané epifluorescenční mikroskopy, jsou mikrsokopy které zachycují veškeré světlo které mají k dispozici v jediné světelné dráze; tento přístup vyžaduje nejméně složitý hardware a je také často vhodný při zobrazování tmavých vzorků. Dekonvoluce se někdy provádí po zobrazení na širokoúhlém mikroskopu, aby se odstranilo rozmazání.

• Konfokální – mikroskopy, které odstraňují neostré světlo ve světelné dráze, obvykle využívající jeden nebo více dírek k fyzickému blokování tohoto světla. Existuje několik variant konfokální mikroskopie; Konfokální mikroskopy s rotujícím diskem jsou často preferovány pro aplikace zobrazování živých buněk, protože mají tendenci minimalizovat toxicitu pro vzorek.

• Multiphoton microscopes utilize multiple pulses of longer-wavelength (lower energy) light to penetrate deep into tissue, since tissues are less likely to scatter these wavelengths; once there, multiple low-energy photons hitting the fluorophore at the same time will use their combined energy to activate a fluorophore that each photon alone would be too weak to do. Because the benefit of these systems is in their deeper penetration, they are often used for performing live-animal imaging.

• Superresoluční mikroskopy jsou navrženy tak, aby uživateli umožnily obejít minimální limit optického rozlišení (obvykle 200 nm, v závislosti na zvážení vzorku) pro rozlišení velmi malých struktur. Někdy je toho dosaženo pomocí specializovaného hardwaru (například STED a SIM) a někdy pomocí specializovaných sond (například PALM a STORM).

• Ligh sheet mikroskopy, které osvětlují vzorek kolmo k ose zobrazování, často druhou, ortogonální sadou čoček objektivu. To umožňuje tenké optické řezy ve velkých objemech, ale přináší více úvah o montáži vzorku. V posledních letech se objevilo mnoho variací na světelných listových mikroskopech.

Důležité

Bez ohledu na to, jaký druh mikroskopu používáte, vědecké mikroskopy jsou složité přístroje s mnoha součástkami, z nichž všechny obvykle musí být v dobrém provozním stavu a musí být správně zkalibrovány/zarovnány, aby mohlo probíhat kvantitativní zobrazování. Správce vašeho mikroskopu to obvykle zajistí, ale pravidelně s ním mluvte o otázkách, které můžete mít, a o tom, jak mohou změny konfigurace mikroskopu ovlivnit vaši schopnost přesně provádět určitá měření. Váš správce mikroskopu může udržovat velký počet mikroskopů s velkým počtem nezávislých uživatelů, takže pokud něco vypadá „nepatrně“, nezapomeňte si s nimi promluvit, než budete pokračovat!