Úvod#
Mikroskopy jsou optické přístroje a jako takové se skládají z různých optických součástí a zařízení. Pro začátečníka je důležité rozpoznat experimentální parametry, které mohou ovlivnit kvalitu a přesnost zobrazovaných dat a potažmo i jejich interpretaci.
Základním konceptem je „světelná dráha“, kterou lze použít ke sledování trajektorie světla od zdroje světla k detektoru. Při práci s mikroskopy, ať už se jedná o mikroskop s buněčnou kulturou nebo špičkový systém s vysokým rozlišením, je důležité věnovat čas sledování různých světelných drah v systému. Přístup k systému jako k součtu jeho částí znamená, že optimalizace a odstraňování problémů se stávají systematickými procesy ve srovnání s tím, kdy je systém považován za černou skříňku. Tento interaktivní výukový program na MicroscopyU ukazuje světelné dráhy ve standardním inverzním mikroskopu; toto zobrazení poskytuje další podrobnosti o různých částech.
Typy mikroskopů#
I když to zdaleka není úplný seznam toho, co je k dispozici, níže je uvedeno několik nejběžnějších typů mikroskopů.
Widefield, někdy nazývané epifluorescenční mikroskopy, jsou mikrsokopy které zachycují veškeré světlo které mají k dispozici v jediné světelné dráze; tento přístup vyžaduje nejméně složitý hardware a je také často vhodný při zobrazování tmavých vzorků. Dekonvoluce se někdy provádí po zobrazení na širokoúhlém mikroskopu, aby se odstranilo rozmazání.
Konfokální – mikroskopy, které odstraňují neostré světlo ve světelné dráze, obvykle využívající jeden nebo více dírek k fyzickému blokování tohoto světla. Existuje několik variant konfokální mikroskopie; Konfokální mikroskopy s rotujícím diskem jsou často preferovány pro aplikace zobrazování živých buněk, protože mají tendenci minimalizovat toxicitu pro vzorek.
Multifotonové mikroskopy využívají více pulzů světla s delší vlnovou délkou (s nižší energií) k pronikání hluboko do tkáně, protože tkáně méně pravděpodobně rozptylují tyto vlnové délky; jakmile tam budou, více nízkoenergetických fotonů dopadajících na fluorofor ve stejnou dobu použije svou kombinovanou energii k aktivaci fluoroforu, na což by byl každý foton sám o sobě příliš slabý. Protože výhodou těchto systémů je jejich hlubší penetrace, často se používají pro zobrazování živých zvířat.
Superresoluční mikroskopy jsou navrženy tak, aby uživateli umožnily obejít minimální limit optického rozlišení (obvykle 200 nm, v závislosti na zvážení vzorku) pro rozlišení velmi malých struktur. Někdy je toho dosaženo pomocí specializovaného hardwaru (například STED a SIM) a někdy pomocí specializovaných sond (například PALM a STORM).
Ligh sheet mikroskopy, které osvětlují vzorek kolmo k ose zobrazování, často druhou, ortogonální sadou čoček objektivu. To umožňuje tenké optické řezy ve velkých objemech, ale přináší více úvah o montáži vzorku. V posledních letech se objevilo mnoho variací na světelných listových mikroskopech.
Důležité
Bez ohledu na to, jaký druh mikroskopu používáte, vědecké mikroskopy jsou složité přístroje s mnoha součástkami, z nichž všechny obvykle musí být v dobrém provozním stavu a musí být správně zkalibrovány/zarovnány, aby mohlo probíhat kvantitativní zobrazování. Správce vašeho mikroskopu to obvykle zajistí, ale pravidelně s ním mluvte o otázkách, které můžete mít, a o tom, jak mohou změny konfigurace mikroskopu ovlivnit vaši schopnost přesně provádět určitá měření. Váš správce mikroskopu může udržovat velký počet mikroskopů s velkým počtem nezávislých uživatelů, takže pokud něco vypadá „nepatrně“, nezapomeňte si s nimi promluvit, než budete pokračovat!